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PCR之经典主力军——Taq DNA聚合酶
来源: | 作者:cnpair | 发布时间: 2023-04-28 | 597 次浏览 | 分享到:
华葵金配基于分子生物学、现代基因工程技术、蛋白质晶体结构解析等对分子酶进行改造筛选,生产出高性能、高品质的Taq DNA聚合酶系列产品,适用于多平台、多场景的PCR检测,可保障扩增的高效性、检测的高敏感性,充分满足客户需求。

自PCR技术诞生以来,越来越多优秀的耐热型DNA聚合酶用于PCR技术,比如Pfu系列、Vent系列、KOD系列,但Taq DNA聚合酶始终是PCR聚合酶的主力军。到目前,Taq酶仍然是市场份额最大,种类最繁多,应用最广泛的热稳型DNA聚合酶。


Taq DNA聚合酶的来源

DNA聚合酶是参与细胞内染色体复制、修复和重组过程的重要酶,它保证了遗传信息被准确地复制而传递给子细胞和后代。根据 DNA聚合酶氨基酸序列和结构分析,可分为七大类:A、B、C、D、X、Y 和逆转录酶(RT)家族[1]。当前发现的耐热DNA聚合酶均属于A群或B群。其中来自A群的 Taq DNA聚合酶是最先被发现并应用于 PCR 的耐热DNA聚合酶。


耐热DNA聚合酶是 PCR 反应体系的核心组分,其性能决定了 PCR 检测的灵敏度、特异性及扩增成功率。1976年,Taq DNA 聚合酶由Chien 等从水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1分离纯化得到[2]。1988 年,Taq DNA聚合酶首次应用于PCR技术[3],是PCR 技术发展过程的里程碑。


Taq DNA 聚合酶的结构与功能

Taq DNA聚合酶全长由832个氨基酸残基组成,分子量为94 kDa,主要包括三个主要结构域,其三维立体结构如图所示。位于 N 端第 1-291 位氨基酸构成了 5’-3’核酸外切酶活性结构域,可应用于TaqMan探针的水解;第292-423位氨基酸构成了 3’-5’核酸外切酶结构域,但该结构域没有活性;第424-832 位氨基酸构成了 5’-3’聚合酶活性结构域,该结构域的三维立体结构如同人的右手,可分为拇指区、手指区和手掌区。其中拇指区负责维持DNA聚合酶与引物-模板复合物的紧密结合,进一步有助于 DNA聚合酶的延伸;手指区负责结合dNTPs;手掌区是二价金属离子结合的活性区域,负责调节结合的dNTPs与引物 3’-OH端发生反应时周围的化学环境,从而介导和催化反应的进行。


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Taq DNA 聚合酶的三维立体结构


Taq DNA聚合酶的酶学特点

01

良好的耐热性,最适催化温度在 75-80℃,95℃半小时后仍保留 50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖型聚合酶,最适浓度范围是 2-4mM。Taq DNA聚合酶还需要单价阳离子,在KCl中具有较大活性。

02

5'-3'聚合酶活性,该特性对温度具有较高的敏感性,70℃时,Taq DNA聚合酶能够以60nt/s的速率聚合DNA链,55℃时降为24nt/s,37℃时为1.5nt/s,22℃时基本停止扩增[4]

03

 5'-3'外切酶活性,Taq DNA聚合酶是少数具有这一活性的DNA聚合酶之一。可利用该活性切除 5’端放射性标记的 DNA 探针,通过放射性信号的变化,实现PCR产物的特异性检测。为 qPCR技术的发展奠定了基础,Taq DNA聚合酶也成了探针法qPCR技术的指定聚合酶。

04

无 3'-5'校正活性,虽然Taq DNA聚合酶与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构相似性(包括3'-5'外切核酸酶结构域),但它缺乏3'-5'外切核酸酶活性,这降低了其在PCR扩增中的忠实性。

05

Taq DNA聚合酶耐受脱氧尿三磷酸(dUTP),可用于dUTP/UDG(脱氧尿三磷酸/尿嘧啶-DNA 糖基化酶)防污染PCR体系的建立。此外,还具有非模板依赖活性[5],可产生3’端突出单A的PCR产物。


Taq DNA聚合酶的热启动修饰

Taq DNA聚合酶在 20℃~37℃下仍有一定聚合酶活性,容易在检测试剂配制和预热过程产生非特异性的扩增。对Taq DNA 聚合酶进行热启动修饰可有效减少非特异性扩增。热启动 DNA 聚合酶的作用过程为:在PCR开始前DNA 聚合酶活性被封闭在PCR体系配制及升温过程中无酶活,从而有效防止了非特异性扩增和引物二聚体的形成;在较高温度热激一段时间后,DNA聚合酶活性得以恢复。使用热启动DNA聚合酶,是提高PCR反应特异性、灵敏度的常用手段[6]


目前Taq DNA聚合酶较为常用的修饰方法为化学修饰和抗体修饰法[7]。抗体修饰改造的热启动 Taq DNA聚合酶依赖的是蛋白质分子间的相互作用力,在使用过程其能快速释放活性,所需要的热激时间短,多为1~2min,相对于化学修饰能缩短高温反应时间并有效保护模板 DNA。


Taq DNA聚合酶应用于POCT qPCR

相对于常规qPCR,由于分子POCT检测的仪器设计要满足小巧便携,样本处理、扩增和检测一体化整合,还要检测速度快捷等性能,因此对Taq DNA聚合酶的要求也更高,需要酶有更快的反应速度、更高的耐热性及常温储存稳定性、以及对抑制物更高的耐受性等性能指标。对于一款特定的分子POCT仪器,往往需要广泛筛选Taq DNA聚合酶,才有可能找到一款或几款合适的Taq DNA聚合酶。甚至还需针对特定检测靶点,对筛选出来的酶及反应体系再进行系统优化。此外,还需要考虑Taq DNA聚合酶与其它试剂在芯片上冻干或风干后的稳定性。



PCR技术是现代分子生物学的重要基石,而Taq DNA聚合酶是PCR技术的经典主力军。Taq DNA聚合酶自身功能和特点为基础通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术对其进行改造,Taq酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体,广泛应用于分子生物学领域,如直接PCR、等位基因检测、Sanger测序、荧光定量PCR、TA克隆等。




华葵金配基于分子生物学、现代基因工程技术、蛋白质晶体结构解析等对分子酶进行改造筛选,生产出高性能、高品质的Taq DNA聚合酶系列产品,适用于多平台、多场景的PCR检测,可保障扩增的高效性、检测的高敏感性,充分满足客户需求。Taq酶产品系列包括裸酶、抗体修饰酶及化学修饰酶,同时提供高质量、强广谱性的Taq酶抗体,对Taq酶具有高效活性位点识别能力和优异的封闭效果。相关产品如下:


  • Taq DNA聚合酶

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  • 修饰抗体

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产品性能优势

Hot Start DNA polymerase

01
高灵敏度,高特异性

使用华葵金配Hot Start DNA polymerase进行甲流病毒保守序列检测,检测结果可看出模板浓度为160拷贝/ml即可检出,且基线平稳,NTC阴性不起峰无拖尾现象,具有高灵敏度和特异性。


灵敏度.png甲流病毒保守序列扩增结果


02
强稳定性

使用华葵金配Hot Start DNA polymerase分别进行37℃加速五天和-20℃反复冻融5次后进行PCR扩增实验,结果表明:处理后扩增曲线基线平稳,拐点清楚,指数期明显,曲线整体平滑,且阴性对照无起峰无拖尾现象,具有超高稳定性。


冻融稳定性.jpg

-20℃反复冻融5次后qPCR扩增结果


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37℃加速5天后qPCR扩增结果


03
高封闭效率

用易产生引物二聚体的PCR体系进行酶封闭活性检测,扩增体系37℃预处理30min后进行PCR,含抗体酶无引物二聚体等非特异性扩增条带产生,不含抗体酶产生引物二聚体扩增条带。

            image.png

1,2,3,4:不同批次抗体修饰Taq酶

5:rTaq对照


04
低核酸残留

外源基因的检测实验结果显示产品中没有外源性基因污染。目前华葵金配分子系列产品的生产采用专用设备在独立生产场地进行,避免与分子克隆、分子检测等实验的交叉,从根本上保证生产线的稳定以及相应的产品不会受到污染。


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A:Control Plasmid, 4E7 copies/mL; 

B:Control Plasmid, 4E6 copies/mL; 

C:Control Plasmid, 4E5 copies/mL; 

D:Control Plasmid, 4E4 copies/mL; 

E:Control Plasmid, 4E3 copies/mL; 

G:Target Sample; 

H:Negative Control.


05
应用广泛

可适用于多重PCR检测,且扩增效果优异,可用于病原体检测、SNP 基因分型和基因表达分析等分子诊断领域。


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多重PCR实验结果






参考文献

[1]Gill J P, Wang J, Millar D P.DNA polymerase activity at the single-molecule level[J]. Biochemical Society Transactions, 2011, 39(2): 595.

[2]Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extremethermophile Thermus aquaticus [J]. Journal of Bacteriology, 1976, 127(3): 1550-1557.

[3]Brock TD. The value of basic research: discovery of Thermus aquaticus and other extreme thermo philes[J].Genetics,1997,146(4):1207-1210.

[4]Innis M A, Myambo K B, Gelfand D H, et al. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, 85(24): 9436-9440.

[5]Baar C, d’Abbadie M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for resistance to environmental inhibitors[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(8): e51-e51.

[6]]Alexandre V L, Natasha P, Joyclyn Y, et al. Hot start PCR with heat-activatable primers:a novel approach for improved PCR performance [J]. Nucleic acids research, 2008, 36(20):e131.

[7]]Spyrydonov V, Pihida D, Sereda A, et al. Production and evaluation of egg derived hotstart antibodies [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2020, 44: 6-13.


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